La película está ambientada durante las Reducciones Jesuíticas, un programa mediante el cual misioneros jesuitas establecieron misiones independientes del estado español para enseñar el cristianismo a los nativos. Cuenta la historia de un sacerdote jesuita español, el padre Gabriel (Jeremy Irons), que se adentra en la jungla sudamericana para construir una misión y convertir una comunidad de indios guaraníes al cristianismo.
En la escena de apertura, un misionero jesuita es amarrado a una cruz por los indios guaraníes que viven sobre las espectaculares Cataratas del Iguazú. Luego, el misionero es enviado a las cataratas, con la cruz y todo, mientras ora fervientemente a Dios. Su martirio inspira al gentil padre Gabriel a escalar las peligrosas cataratas e intentar acercarse a la tribu. Inicialmente, los guerreros guaraníes se preparan para matarlo, pero luego de que Gabriel toca un solo inolvidable en su oboe, lo dejan vivir y poco a poco se gana su confianza.
El mercenario y esclavista Rodrigo Mendoza (Robert De Niro) se gana la vida secuestrando nativos y vendiéndolos a plantaciones cercanas, incluida la plantación del gobernador español Cabeza (Chuck Low). Posteriormente, Mendoza encuentra a su prometida (Cherie Lunghi) y a su medio hermano menor Felipe (Aidan Quinn) en la cama juntos. Mata a Felipe en duelo. Aunque es absuelto del asesinato de Cabeza, Mendoza cae en una espiral de depresión. El padre Gabriel visita y reta a Mendoza a realizar una penitencia adecuada. Mendoza acompaña a los jesuitas en su viaje de regreso, arrastrando un pesado bulto que contiene su armadura y espada. Luego de unos momentos inicialmente tensos al llegar a las afueras del territorio de los nativos, aunque lo reconocen, los nativos abrazan a un Mendoza lloroso y cortan su pesado bulto.
La misión del padre Gabriel se describe como un lugar de santuario y educación para los guaraníes. Conmovido por la aceptación de los guaraníes, Mendoza desea ayudar en la misión y el padre Gabriel le entrega una Biblia. Con el tiempo, Mendoza hace votos y se convierte en jesuita con el padre Gabriel y su colega el padre Fielding (Liam Neeson).
Si la violencia es lo que cuenta, entonces no tengo fuerzas para vivir en un mundo así.”
Las misiones jesuitas estaban a salvo, porque estaban protegidas por la ley española. El Tratado de Madrid (en el año 1750) redistribuye la tierra en América del Sur. La tierra en la que estaban ubicadas las misiones jesuitas fue transferida a los portugueses, y la ley portuguesa permite la esclavitud. Los colonos portugueses buscan esclavizar a los nativos, y como las misiones jesuitas independientes podrían impedirlo, el emisario papal, el cardenal Altamirano (Ray McAnally), un ex sacerdote jesuita, es enviado desde el Vaticano para inspeccionar las misiones y decidir cuáles, si las hay, se debe permitir que permanezca.
Así pues, vuestra Santidad, vuestros sacerdotes están muertos y yo sigo vivo. Pero en verdad soy yo quien ha muerto, y ellos son los que viven. Porque como ocurre siempre, los espíritus de los muertos sobreviven en la memoria de los vivos”
Bajo la presión de Cabeza y del gobernador portugués, Don Hontar (Ronald Pickup), el cardenal Altamirano se ve obligado a elegir entre dos males. Si gobierna a favor de los colonos, los pueblos indígenas serán esclavizados; si falla a favor de las misiones, toda la Orden de los jesuitas puede ser condenada por los portugueses y la Iglesia católica europea podría fracturarse. Altamirano visita las misiones y se sorprende de su industria y éxito, tanto en la conversión de los indígenas como, en algunos casos, económicamente.
En la misión del padre Gabriel en San Carlos, trata de explicar las razones del cierre de la misión e instruye a los guaraníes que deben irse. Los guaraníes cuestionan su autoridad y el padre Gabriel y Mendoza, bajo amenaza de excomunión, manifiestan su intención de defender la misión en caso de ataque de los hacendados y colonos. Sin embargo, están divididos sobre cómo hacer esto y debaten cómo responder al inminente ataque militar. El padre Gabriel cree que la violencia es un crimen directo contra Dios. Mendoza, sin embargo, decide romper sus votos de defender militarmente la Misión. Contra los deseos del padre Gabriel, enseña a los indígenas el arte europeo de la guerra y vuelve a empuñar su espada.
Cuando una fuerza conjunta de soldados portugueses y españoles ataca, la misión es inicialmente defendida por Mendoza, Fielding y los guaraníes. No son rival para la fuerza militar y Mendoza es baleado y herido de muerte. Cuando los soldados ingresan a la aldea de la misión, son detenidos por el canto del padre Gabriel y las mujeres y niños guaraníes que marchan en la procesión. Los soldados se resisten a disparar en una misa. A pesar de ello, el comandante portugués ordena el ataque y el padre Gabriel, el resto de los sacerdotes y la mayoría de los guaraníes, entre ellos mujeres y niños, son baleados. Solo un puñado escapa a la jungla. Fielding se sacrifica matando al comandante portugués y algunos soldados más antes de que él mismo muera.
En un intercambio final entre el cardenal Altamirano y Don Hontar, Hontar lamenta que lo sucedido fue lamentable pero inevitable porque «hay que trabajar en el mundo, el mundo es así». Altamirano responde: «No, así hicimos el mundo. Así lo hice yo».
